Elektroforeza: ločevanje molekul z veliko natančnostjo

Elektroforeza je učinkovita laboratorijska tehnika, ki ločuje in analizira molekule glede na njihovo velikost, naboj in druge fizikalne lastnosti. Postala je nepogrešljivo orodje na številnih področjih znanstvenih raziskav, vključno z biokemijo, molekularno biologijo, genetiko in proteomiko.

Načelo elektroforeze je preprosto: na vzorec, ki vsebuje molekule z različnimi lastnostmi, deluje električno polje, ki povzroči njihovo gibanje skozi medij, kot je gel ali raztopina. Na gibanje molekul vplivajo njihova velikost in naboj ter lastnosti medija in moč električnega polja.

Različne vrste elektroforeze se uporabljajo za ločevanje različnih vrst molekul, kot so beljakovine, nukleinske kisline in ogljikovi hidrati. V tem članku bomo raziskali načela in uporabo elektroforeze ter nekatere temeljne tehnike in tehnologije, ki se uporabljajo na tem področju.

Elektroforeza temelji na dejstvu, da se nabite molekule premikajo v električnem polju. Na to gibanje vpliva več dejavnikov, vključno z velikostjo in obliko molekule, nabojem na molekuli, močjo električnega polja in lastnostmi medija, po katerem se molekula giblje.

Medij, ki se uporablja pri elektroforezi, je lahko gel ali raztopina. Pri gelski elektroforezi se vzorec naloži na matrico gela, običajno agarozo ali poliakrilamid. Gelska matrica deluje kot molekularno sito in ločuje molekule glede na velikost. Manjše molekule se lažje premikajo skozi gel kot večje molekule, tako da v določenem času prepotujejo daljše razdalje.

Pri raztopinski elektroforezi se vzorec raztopi v puferski raztopini, ki vsebuje elektrolit, ta pa prenaša naboj. Elektrolit omogoča pretok električnega toka skozi vzorec in pomaga zmanjšati spremembe pH v vzorcu med elektroforezo. Vzorec se namesti v komoro z dvema elektrodama, po eno na vsakem koncu, čez komoro pa se uporabi električno polje. Molekule v vzorcu se pomikajo proti elektrodi z nasprotnim nabojem.

Elektroforeza se pogosto uporablja v znanstvenih raziskavah, zlasti v biokemiji, molekularni biologiji, genetiki in proteomiki. Dvodimenzionalna gelska elektroforeza (2DGE) je priljubljena tehnika, ki lahko v enem vzorcu loči na tisoče proteinov. Proteini se najprej ločijo glede na izoelektrično točko (pI) v prvi dimenziji, nato pa glede na molekulsko maso v drugi dimenziji. To raziskovalcem omogoča analizo celotnega proteoma celice ali tkiva in ugotavljanje sprememb v izražanju beljakovin pod različnimi pogoji.

Analiza nukleinskih kislin: Elektroforeza se uporablja tudi za analizo nukleinskih kislin, zlasti DNA in RNA. Agarozna gelska elektroforeza je običajna tehnika za ločevanje fragmentov DNA glede na velikost. DNA se naloži na matrico gela, nato pa se uporabi električno polje. Fragmenti DNA migrirajo skozi gel, pri čemer manjši fragmenti potujejo dlje kot večji. Tako lahko raziskovalci ločijo fragmente DNA za analizo, na primer sekvenciranje ali razgradnjo z restrikcijskimi encimi.

Poleg tega je treba razkužila uporabljati varno in odgovorno. Nekatera razkužila so lahko ob zaužitju ali vdihavanju strupena in lahko ob napačni uporabi povzročijo škodo. Pri ravnanju z razkužili in njihovi uporabi je treba prebrati in upoštevati navodila proizvajalca ter nositi zaščitno opremo, kot so rokavice in zaščitna očala.

Klinična diagnostika: Z elektroforezo se v vzorcih krvi ali urina identificirajo in kvantificirajo beljakovine ali encimi. To je lahko koristno za odkrivanje bolezni, kot so sladkorna bolezen, bolezni jeter ali rak, in spremljanje učinkovitosti zdravljenja.

Z leti so bile razvite številne tehnike in tehnologije za izboljšanje natančnosti, občutljivosti in hitrosti elektroforeze. Nekatere temeljne tehnike in tehnologije, ki se uporabljajo pri elektroforezi, vključujejo kapilarno elektroforezo (CE). 

Kapilarna elektroforeza je tehnika visoke ločljivosti, s katero lahko ločimo in analiziramo majhne molekule, kot so aminokisline, peptidi in nukleotidi. Uporablja ozko kapilarno cevko, napolnjeno z ločilnim medijem, vzorec pa se vbrizga na enem koncu kapilare. Čez kapilaro deluje električno polje, molekule v vzorcu pa migrirajo skozi kapilaro glede na svoj naboj in velikost. CE je koristna za analizo kompleksnih mešanic, kot so metaboliti ali zdravila.

Eden od naših ključnih izdelkov je oprema za elektroforezo, ki vključuje sistem Qiaxcel connect – napravo za kapilarno elektroforezo podjetja Qiagen.

Elektroforeza brez gela: razvite so bile tehnike elektroforeze brez gela, da bi odpravile nekatere omejitve tradicionalne elektroforeze z gelom, kot so slaba občutljivost, ločljivost in ponovljivost. Te tehnike za ločevanje in analizo proteinov ali peptidov uporabljajo alternativne ločilne medije, kot sta kromatografija z ionsko izmenjavo ali izoelektrično fokusiranje.

Multipleksna elektroforeza: tehnike multipleksne elektroforeze omogočajo hkratno analizo več vzorcev na enem samem gelu ali kapilari. S tem lahko prihranimo čas, zmanjšamo količino dela z vzorci in omogočimo neposredne primerjave med vzorci. Multipleksno elektroforezo lahko dosežemo z uporabo različnih fluorescenčnih oznak na vsakem vzorcu ali različnih vdolbin za nalaganje vzorcev na enem gelu ali kapilari.

Sekvenciranje naslednje generacije (NGS – Next-generation sequencing): sekvenciranje naslednje generacije je zmogljiva tehnika, ki lahko vzporedno sekvencira milijone fragmentov DNA. NGS je revolucionirala področje genomike, saj raziskovalcem omogoča sekvenciranje celotnih genomov, transkriptomov ali epigenomov v enem samem poskusu. NGS temelji na elektroforezi za ločevanje in pomnoževanje fragmentov DNA, ki se sekvencirajo z visoko zmogljivimi tehnologijami.

Elektroforeza je vsestranska in zmogljiva tehnika, ki je revolucionarno spremenila številna področja znanstvenih raziskav. Omogoča ločevanje in analizo molekul na podlagi njihove velikosti, naboja in drugih fizikalnih lastnosti. Uporablja se v biokemiji, molekularni biologiji, genetiki in proteomiki. Z leti je bilo razvitih veliko različnih tehnik in tehnologij za izboljšanje natančnosti, občutljivosti in hitrosti elektroforeze, vključno s kapilarno elektroforezo, elektroforezo brez gela, multipleksno elektroforezo in sekvenciranjem naslednje generacije. Z razvojem znanstvenih raziskav bo elektroforeza ostala ključno orodje za ločevanje in analizo molekul.